甘蓝型油菜组织特异性启动子的分离与鉴定

【摘要】甘蓝型油菜(Brassicanapus)作为我国最重要的油料作物之一,已成为国产食用植物油的第大来源,2009年菜籽油已占国产油料作物产油的57%以上,但国内食用植物油自给率不到40%,且南方冬闲田油菜产量和含油量较低、抗性较弱且不适宜机械化操作,而通过基因工程技术分离出具有较高应用价值的启动子来提高油菜抗性和光合效率等性状,逐步扩大和提高其种植面积与产量,为有效解决我国植物油问题具有重要意义。组织特异启动子能专门调控基因在特定的组织部位或器官中表达,不仅可以克服组成型启动子驱动外源基因的非特异持续表达所造成浪费以及特定部位表达量上的不足,还有效避免转基因作物种植中发生的基因逃逸现象,有效的解决了转基因环境安全问题。因此,从甘蓝型油菜中分离和鉴定油菜自身的组织特异性启动子,并研究其转录调控的分子机制,为油菜及其近缘物种的基因功能研究和基因工程改良奠定基础。本研究首先根据拟南芥基因芯片和白菜与甘蓝表达谱数据,筛选在根、茎、叶、花组织中特异表达候选基因,并利用实时荧光定量PCR方法对候选基因进行组织特异性检测和表达模式分析；其次,利用5’RACE技术获得其准确的转录起始位点,通过同源克隆方法获得RO-4、LE-7、FL-1、FL-4和ST-7启动子序列,并利用PlantCARE数据库对其顺式调节元件进行了预测和分析。最后,利用双酶切技术构建其相应的植物表达载体并通过农杆菌介导法遗传转化中油821下胚轴,通过转基因植株验证分析启动子表达的特异性和表达强度。同时为了进一步研究特异启动子中的核心序列位置与功能,分别设计不同长度的启动子片段,采用Gateway克隆技术构建启动子的缺失表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,验证启动子中核心序列的位置及功能。具体结论如下：1.采用生物信息学分析方法从拟南芥基因芯片及白菜与甘蓝表达谱数据中筛选鉴定出24个组织特异表达的候选基因,从24个候选基因中获得了14个组织特异表达基因,qPCR分析结果表明RO-4在根部特异表达、LE-7在叶片特异表达、ST-7在根茎角果皮中特异表达、FL-1和FL-4在花器官特异表达。通过对qPCR检测片段、5’RACE末端及基因5’末端序列测序结果分析证实扩增片段是来自qPCR检测为组织特异表达的候选基因基因,启动子的长度为1305-1566bp(包含5’-UTR序列),转录起始位点分别位于翻译起始位点上游53-269bp,并包含核心启动元件TATA-box及多个增强子元件CAAT-box,另外光响应、胁迫响应和激素响应元件也广泛存在于启动子中。2.克隆获得5个组织特异启动子片段,分别是RO-4(1475bp),LE-7(1566bp)、FL-1(1372bp)、FL-4(1517bp)和ST-7(1305bp),利用BamHI和NcoI双酶切将RO-4、LE-7、FL-1和FL-4分别亚克隆到相同酶切位点的粘性末端载体骨架pCAMBIA1305.1上,最终成功构建promoter-GUS载体p13O5.1-RO-4P、p1305.1-LE-7P、p1305.1-FL-1P和p1305.1-FL-4P；同样利用SacI/NcoI双双酶切将ST-7替换pCAMBIA13O5.1上的CaMV35S启动子,构建植物表达载体p1305.1-ST-7P。然后将构建的植物表达载体成功转化到农杆菌菌株GV3101中获得工程菌株。3.将构建的植物表达载体p1305.1-RO-4P和p1305.1-LE-7P通过下胚轴浸染法遗传转化甘蓝型油菜DH系中油821,经多重PCR鉴定,成功获得p1305.1-RO-4P和p1305.1-LE-7P转基因阳性植株,GUS组织化学染色证实LE-7启动子主要在叶片中表达,在花和花蕾、根、角果皮中基本上不表达；RO-4启动子在叶片边缘表达,其他部位因生长情况还未检测。4.克隆获得6个RO-4缺失启动子,分别是R1(1301bp)、R2(1030bp)、R3(622bp)、R4(481bp)、R5(352bp)和R6(252bp)；5个LE-7P缺失启动子即L1、L2、L3、L4和L5,长度分别为925bp、755bp、526bp、350bp和231bp。分别与表达载体质粒pMDC162进行LR重组反应构建了相应片段的缺失表达载体,并成功转入农杆菌菌株GV3101,获得工程菌株。
【作者】赵雪花；
【导师】李加纳；卢坤；
【作者基本信息】西南大学，作物遗传育种，2014，硕士
【关键词】甘蓝型油菜；组织特异启动子；植物表达载体；遗传转化；GUS；

【参考文献】
[1]薛冬燕.县级市行政服务中心优化服务问题研究[D].苏州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[2]蒙堃堃.线描在当代工笔花鸟画中的应用研究[D].广西师范大学,美术学,2013,硕士.
[3]安震鹏.基于3G网络的煤层气开采远程监控系统[D].大连理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[4]王锋,顾欲晓,李堑,齐志高,袁育芬.浅谈“中央直属储备粮库信息查询系统”的开发及应用[A].中国粮油学会.中国粮油学会第二届学术年会论文选集（综合卷）[C].中国粮油学会:,2002:5.
[5]田浩然.四平市市区水资源可持续利用的优化配置研究[D].吉林大学,地下水科学与工程,2013,硕士.
[6]梁国坚.基于母线差动保护的电子式与电磁式互感器同步应用[J].电力系统自动化,2011,03:97-99.
[7]刘鹏.数据挖掘技术在税务稽查中的研究与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2011,硕士.
[8]魏萍.慢性鼻—鼻窦炎伴息肉患者AhR表达与Th17反应相关性及AhR配体干预的研究[D].重庆医科大学,耳鼻咽喉科学,2014,博士.
[9]张红坡.物体相似性对空间参照系的影响[D].南京师范大学,发展与教育心理学,2012,硕士.
[10]彭勇.RNA干扰HIF-1α基因对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的VEGF表达及其增殖的影响[D].宁波大学,内科学,2014,硕士.
[11]易礼.以房养老模式研究[D].山西财经大学,社会保障,2013,硕士.
[12]张奎.面向烟草销售行业CRM管理系统[D].山东大学,2005.
[13]陈烽.大学英语四级考试对于大学英语教学的反拨效应[D].大连海事大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[14]马伟霞.武汉市外来人口就业—居住关系及影响因素研究[D].华中师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[15]赵晓明.摩加迪沙之战及其对美国对外干预政策的影响[D].渤海大学,世界史,2013,硕士.
[16]孔令娟.pRb、E2F-1及P21在多发性骨髓瘤骨髓组织中的表达及临床意义[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[17]顾立,谭智勇,曹俊诚.太赫兹通信技术研究进展[J].物理,2013,10:695-707.
[18]奚志勇.上海合流污水一期出口泵站的自动化控制[J].上海建设科技.1996(06)
[19]刘华.我国增值税法实施存在的问题及对策[D].贵州民族大学,经济法学,2014,硕士.
[20]李楠,高峰,田昊,张天宝.九开关变换器脉宽调制策略[J].电力系统自动化,2014,03:83-88.
[21]刘硕.WRF-EnSRF同化系统局地化及协方差膨胀自适应方案的实现与研究[D].南京信息工程大学,气象学,2012,硕士.
[22]王赟.石墨烯用于锂离子电池负极材料的应用基础研究[D].华东理工大学,2014.
[23]刘静.格式塔意象再造理论视角下的《长恨歌》英译本比较研究[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[24]缪成贵.SFRP4在佐剂性关节炎大鼠病理变化中的作用及其表观遗传学修饰[D].安徽医科大学,药理学,2014,博士.
[25]王之元.DICOM医学影像自适应显示技术的研究与实现[D].内蒙古科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[26]李春芝,菅阳阳,何颖卓.基底性质对二维层状电子气感应电场的影响[J].强激光与粒子束,2014,12:206-210.
[27]姜园,张朝阳,仇佩亮,戚玉鹏.对聚类算法普遍存在问题的解决办法[J].电路与系统学报,2004,03:92-99.
[28]杨海生,刘云生.适合起伏地表的炮点波场延拓正演模拟[J].石油地球物理勘探,2009,02:146-151+124+255.
[29]潘刚峰.香港特别行政区大学内部治理规定及启示[D].湖南大学,高等教育学,2013,硕士.
[30]任雅静.土地利用规划研究[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[31]庞博.批量MEMS陀螺信息融合技术研究[D].哈尔滨工业大学,飞行器设计,2013,硕士.
[32]赵建交.中职学校会计专业工学结合人才培养模式的研究[D].湖南师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[33]肖晖.裂缝性储层水力裂缝动态扩展理论研究[D].西南石油大学,油气田开发工程,2014,博士.
[34]顾兆平.用微处理机测定冷轧速度、延伸率和滑移(摘译)[J].冶金自动化,1983,04:58-59.
[35]郑辰.复合螺杆结构对挤出熔体压力波动的研究[D].大连理工大学,化学工程（专业学位）,2013,硕士.
[36]郭云,谭克虎.快递产品时效性与快递企业边界问题研究[J].商业经济与管理,2015,01:5-12+18.
[37]彭春雪.干旱胁迫下甜菜生理及蛋白质组差异分析[D].黑龙江大学,生态学,2013,硕士.
[38]刘翔,孙优贤.具有最优动态性能的鲁棒镇定控制器设计[J].控制与决策,2000,01:11-14.
[39]庞超.布拉氏酵母菌对肝硬化大鼠肠黏膜屏障保护作用的实验研究[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[40]李钢小.卫星远程教育网络交互式通信技术研究[D].内蒙古大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[41]许松莉.L集团酒店筹备期采购流程优化[D].厦门大学,物流工程,2014,硕士.
[42]张宇.排班管理系统的研究与实现[D].电子科技大学,计算机技术（专业学位）,2012,硕士.
[43]李聪.CdTe量子点增敏碱性鲁米诺—高碘酸钾化学发光体系的分析应用[D].西北师范大学,2014.
[44]杨振永.高效能低成本湿强剂的合成及其在防水原纸中的应用[D].齐鲁工业大学,轻工技术与工程,2014,硕士.
[45]余世策,蒋建群,楼文娟,孙炳楠.大型回流边界层风洞的气动与结构设计[J].实验流体力学,2014,02:59-64+68.
[46]马文君.《菜根谭》人生态审美探析[D].西北民族大学,文艺学,2012,硕士.
[47]瞿望.锡林浩特褐煤反浮选试验研究[D].中国矿业大学,矿业工程,2014,硕士.
[48]魏秋芳,杨雪松,张政.石墨烯导电性能的应用研究进展[J].辽宁化工,2014,09:1192-1194.
[49]王春娟.农村税费的征收：制度与运作[D].华中师范大学,政治学理论,2004,硕士.
[50]郎越.抚顺市初中体操课开展现状调查与分析[D].辽宁师范大学,体育教育训练学,2012,硕士.